Полимеразная цепная реакция ПЦР

Содержание

ПЦР-анализ: что это такое, когда он назначается и как проводится

Высокотехнологичные лабораторные методы диагностики дают возможность выявить множество заболеваний на самых ранних стадиях. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — один из самых новых и точных способов диагностики. За его разработку ученый Кэри Муллис получил в 1993 году Нобелевскую премию. Сегодня этот метод хотя и считается экспериментальным, но уже широко и успешно применяется в медицине.

ПЦР-диагностика: суть подхода

Метод ПЦР использует принципы молекулярной биологии. Его суть заключается в применении особых ферментов, которые многократно копируют фрагменты РНК и ДНК возбудителей болезни, которые находятся в пробах биоматериала, например в крови.

После этого работники лаборатории сверяют полученные фрагменты с базой данных, выявляют тип возбудителя болезни и его концентрацию.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, охлаждающем и нагревающем пробирки с пробами биоматериала. Нагрев и охлаждение необходимы для проведения репликации. Точность температурного режима влияет на точность результата.

Сферы применения метода

Диагностические возможности метода ПЦР огромны, с его помощью можно выявить самые разные инфекции. Чаще всего ПЦР-метод применяют для диагностики:

  • ВИЧ;
  • герпеса;
  • различных половых инфекций, в частности хламидиоза, уреаплазмоза, гарднереллеза, микоплазмоза и трихомониаза;
  • кандидоза;
  • гепатитов;
  • мононуклеоза;
  • листериоза;
  • цитомегаловируса;
  • туберкулеза;
  • вируса папилломы человека;
  • клещевого энцефалита.

Это далеко не полный список, метод ПЦР-анализа используется в разных областях медицины.

Кстати
Метод ПЦР применяется не только в медицинских целях. В наши дни он используется и в иных сферах, например в криминалистике, в тех случаях, когда требуется определить, кому принадлежит найденный на месте преступления биоматериал. ПЦР иногда используется также при установлении отцовства.

Преимущества и недостатки подхода

У диагностики методом ПЦР много плюсов:

Высокая чувствительность. Метод позволяет выявить возбудителя болезни даже при наличии нескольких молекул его ДНК, то есть на очень ранних стадиях, при хронической форме заболевания, а так же в случаях, когда болезнь никак себя не проявляет, протекая латентно.

Универсальность. Для проведения ПЦР анализа подходит почти любой биоматериал — от крови и слюны до клеток кожи.

Широкий охват. Исследование одного образца может выявить сразу нескольких возбудителей болезни.

Оперативность. Результат, как правило, готов через 5–7 часов, то есть получить заключение можно уже на следующий день после забора биоматериала.

Точность. Метод ПЦР практически никогда не дает ложноположительных или ложноотрицательных результатов, если была соблюдена технология проведения этого анализа.

Невысокая стоимость. По цене ПЦР-анализ сравним с любыми другими лабораторными анализами крови.

Однако следует понимать, что совершенных методов анализа не бывает. У ПЦР есть и минус — высокие требования к соблюдению технологии и к профессионализму лаборантов. Если образец был загрязнен, анализ может дать ложный результат. Поэтому проводить ПЦР-диагностику лучше только в самых лучших лабораториях, где внедрены системы контроля качества работы.

Исследуемый биоматериал

Для ПЦР-диагностики заболеваний на анализ берут разные виды биоматериала. Выбор зависит от типа инфекции. При анализе на ЗППП методом ПЦР берут соскоб или мазок из шейки матки или уретры, а также мочу. Для выявления герпеса, цитомегаловируса, гепатита, токсоплазмоза и ВИЧ на анализ берут кровь. При анализе на мононуклеоз и цитомегаловирус берут мазок из зева. Спинномозговая жидкость используется для анализа при поражениях нервной системы, для диагностики внутриутробных инфекций исследуются ткани плаценты, для выявления легочных инфекций — мокрота или плевральная жидкость.

Подготовка к исследованию

Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала. Кровь сдается натощак утром. Моча также сдается утром, в лабораторных условиях, в стерильный контейнер. Перед сдачей мазка или соскоба из урогенитальной области нельзя вступать в половые контакты за несколько дней до исследования, не следует проводить спринцевания. Мазок или соскоб нельзя сдавать во время менструации и в течение 2-х дней после ее окончания.

Методы ПЦР-диагностики заболеваний

Существует немало различных методик ПЦР-диагностики: ПЦР в реальном времени, секвенирование, пиросеквенирование, микрофлюидные технологии. Сейчас наиболее распространенным способом проведения анализа является ПЦР в реальном времени — этот метод практически не допускает ложноположительных результатов, к тому же срок обработки образцов при исследовании таким способом сокращается — результат можно получить уже через час.

Расшифровка результатов

Для пациента результат ПЦР-анализа может быть либо положительным, либо отрицательным. Отрицательный означает, что следов враждебной ДНК не обнаружено и человек здоров. Положительный подразумевает наличие фрагментов ДНК возбудителя болезни — это значит, что человек заражен и ему требуется лечение.

Нередко ПЦР-диагностика дает положительный результат, но пациент не чувствует никакого недомогания, а признаки болезни отсутствуют. Однако это означает не ошибку, а очень раннюю стадию заболевания. В этом случае необходимы дополнительные исследования и лечение. Если заболевание было диагностировано на столь ранней стадии, следует начинать терапию как можно скорее, ведь чем дальше зайдет болезнь, тем сложнее будет ее вылечить.

ПЦР-диагностика инфекций невероятно точна — она позволяет обнаружить возбудителя болезни, даже если в пробе находится всего одна-единственная молекула его ДНК. Именно это качество сделало ПЦР-анализ одним из эффективнейших диагностических инструментов как для определения наличия инфекции, так и для контроля за ходом лечения.

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).

Принцип ПЦР- исследования

У каждого живого существа, по крайней мере, на нашей планете, есть уникальный «отпечаток» — ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), которая отвечает за передачу наследственных факторов от предков к потомкам. Структурно эта молекула представляет собой две нити из молекул-азотитых оснований, удерживаемые рядом друг с другом химическими связями и скрученные в спираль (считается, что для компактности). Из курса биологии вы можете помнить такие названия, как аденин (А), гуанин (Г), тимидин (Т) и цитозин (ц). Это 4 нуклеотида, которые и создают последовательность ДНК. Вирусы хранят свою генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК.
Информация об уже изученных ДНК и РНК хранится в научных базах лабораторий. После того, как был изобретен метод ПЦР, для многих возбудителей различных заболеваний (бактерии, грибки и вирусы) были созданы свои специфические генетические детекторы (праймеры) — уникальные последовательности нуклеотидов, характерных только для конкретного возбудителя. И если поместить их в пробирку с исследуемым материалом, при наличии в нем ДНК или РНК «живых» возбудителей, праймеры запускают реакцию репликации – создания огромного числа копий, которое можно идентифицировать визуально. Т.е. они начинают копировать свою ДНК/РНК десятки раз.
И при подсчете результатов сотрудники лаборатории могут понять, есть ли искомые бактерии и вирусы в исследуемом образце, или нет, именно поэтому результаты ПЦР чаще всего качественные, т.е. «обнаружено» или «не обнаружено».

Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.

Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.

В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.

Как это все происходит в лаборатории

Выделение ДНК

Сначала пробу биологического материала подготавливают: центрифугируют, осаждают и т.д. Затем лаборантам необходимо выделить ДНК из полученного биологического концентрата.
Амплификация (увеличение числа копий ДНК)
Важнейший этап исследования. Проводится в термоциклере и именно здесь проходят все процессы, подпадающие под определение полимеразно-цепная реакция: денатурация, отжиг, элонгация.
Денатурация
Самый первый этап – развернуть (денатурировать) нуклеиновые кислоты, чтоб сделать их доступными для дальнейшей работы. Осуществляется путем нагрева реакционной смеси до 80-90 °C.
Отжиг
Денатурированные (распущенные) ДНК/РНК обрабатывают праймерами — изготовленными в лабораторных условиях коротенькими цепочками нуклеиновых кислот. Благодаря запрограммированному участку, праймеры прикрепляются только к тем нуклеиновым кислотам, для которых были созданы. Например, праймер для вируса простого герпеса 1 типа, никогда не свяжется с ДНК другого вируса, микроорганизма или клетки.
Именно праймеры обусловливают крайне высокую специфичность ПЦР – способность реагировать только на нуклеиновые молекулы конкретных типов, видов классов и даже штаммов микроорганизмов. Или отдельные виды клеток живых организмов.

Элонгация

Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.

Детекция

Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:

  1. Электрофорез в вязкой среде. Суть в том, что ДНК/РНК заряжены электрически и движутся к одному из электродов. В среду (агар или полиакридный гель) добавляют краситель ДНК (например – бромистый этидий). В процессе сеанса электрофореза, молекулы нуклеиновых кислот движутся и формируют скопления, подкрашенные этидием. Под ультрафиолетом, это выглядит в виде полосок разной толщины и яркости.
  2. Метод гибридизации. Используются праймеры, заранее помеченные люминофором (флуорофором). После нужного числа температурных циклов, применяют специальный прибор – детектор флюоресценции. За счет того, что в образец можно добавлять флуорофоры для разных мишеней (они будут и светиться под ультрафиолетом разным цветом), метод гибридизации подходит для диагностики сразу нескольких мишеней в одном образце.
  3. ПЦР диагностика в реальном времени (real-time PCR). Отличается тем, что детекция проводится прямо в процессе амплификации. Для этого нужны зонды-люминофоры (из предыдущего пункта) и специальные приборы ДНК-амплификаторы. Эти устройства оценивают нарастание яркости люминофора после каждого температурного цикла и впоследствии, вычисляют исходное число искомых нуклеиновых кислот в образце.

Электрофорез и гибридизация подходят только для качественной оценки, то есть дают ответ на вопрос, есть ли в образце искомый материал. ПЦР в реальном времени – единственный доступный метод количественной оценки.
Если мишеней для праймеров в образце не окажется, то температурные циклы пройдут в холостую и при детекции будет получен отрицательный результат.

Преимущества методики ПЦР

Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).

Области применения в медицине

В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.

Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:

пцр диагностика на Инфекции:

Диагностика методом ПЦР: современный подход выявления инфекционных и генетических заболеваний

За звучной аббревиатурой ПЦР скрывается сложная и не слишком понятная для рядового пациента расшифровка — полимеразная цепная реакция. Что же такое ПЦР-диагностика, на чем она основана и почему в последнее время ее стали считать самой перспективной технологией в постановке диагнозов, касающихся инфекционных и вирусных заболеваний? Мы расскажем о преимуществах ПЦР-метода, его особенностях и этапах проведения.

ПЦР-диагностика: что это такое?

Диагностика методом ПЦР существует чуть более 30 лет. Значительно эволюционировав за это время, она зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. В основе метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Цикл образования новой молекулы ДНК занимает всего около 3 минут, а тридцати-сорока циклов вполне достаточно, чтобы получить количество молекул, необходимое для достоверного визуального определения методом электрофореза.

Кроме амплификации, то есть простого увеличения числа копий молекулы ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это позволяет использовать ПЦР не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

ПЦР-диагностика проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. На сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов рибонуклеиновой кислоты (РНК). В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Широко применяется такой прием, как «горячий старт ПЦР», при котором пробирки с амплификационной смесью предварительно прогревают при температуре 95°С в течение 3–5 минут, для того чтобы избежать клонирования неспецифических ДНК-фрагментов.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Это не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет рассматривать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше увеличивает точность исследования методом ПЦР.

Сферы применения метода в клинической медицине

В клинической медицине ПЦР-диагностика является одним из наиболее востребованных методов анализа в самых разных сферах:

  1. Урогинекология . Для инфекционных заболеваний такого рода характерны слабая выраженность симптомов и хроническое течение, нередко вызывающие бесплодие и невынашивание беременности у женщин. С помощью ПЦР можно выявить наличие целого «букета» половых инфекций: хламидиоза, нескольких видов микоплазмы, уреаплазмы, трихомониаза, гарднереллы, кандиды, гонококка, трепонемы. Кроме этого, ПЦР-диагностике поддается и группа вирусов, поражающих урогенитальный тракт у обоих полов, в особенности, вирус герпеса и вирус папилломы человека. Их своевременное выявление и лечение помогает избежать риска злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.
  2. Неонатология . Существует множество микроорганизмов, способных поражать плод еще в утробе матери. ПЦР-диагностика позволяет эффективно выявлять наличие неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. К опасным инфекциям относятся цитомегаловирус, токсоплазмы, вирусы краснухи и герпеса, хламидии, микоплазмы.
  3. Служба крови . Чтобы избежать риска переливания, пациентам инфицированной опасными заболеваниями крови или плазмы (ВИЧ, сифилис, гепатиты) также используется метод ПЦР. Он значительно превосходит по точности серологические методы, поскольку способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.
  4. Клиника инфекционных заболеваний . К ним относятся вирус гепатита, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия, токсоплазмоз и другие инфекции.
  5. Фтизиатрия и пульмонология . ПЦР-диагностика позволяет выявить возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, которыми являются хламидии и микоплазмы. Кроме того, с ее помощью можно не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, т.е. выявить конкретный штамм. Метод ПЦР используется также для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.

На заметку
ПЦР-диагностика используется в криминалистике для определения принадлежности найденного на месте преступления биоматериала, а также в экспериментальной медицине, создании генетических паспортов, мониторинге состояния окружающей среды, анализе продуктов питания, фармакологии, ветеринарии.

Преимущества ПЦР-диагностики

Хотя ПЦР-диагностика и является относительно «молодым» методом, широкое распространение в медицинской практике она получила благодаря явным преимуществам перед другими способами анализа:

  • Прямое определение возбудителя инфекции. Некоторые традиционные методы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), выделяют только белки-маркеры, которые являются продуктом жизнедеятельности возбудителей инфекции, а потому только косвенно указывают на присутствие микроорганизмов. Наличие специфического участка в ДНК, выявленное с помощью ПЦР, безошибочно или почти безошибочно указывает на присутствие конкретной инфекции.
  • Высокая специфичность метода . Она обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется фрагмент ДНК, характерный только для конкретного возбудителя инфекции. Специфичность исключает возможность ложных результатов анализа, тогда как в иммунологических методах исследований ошибки вполне вероятны из-за перекрестной реакции антигенов.
  • Высокая чувствительность . При помощи ПЦР-диагностики можно выявить присутствие в организме даже единичных клеток вирусов или бактерий в тех случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. ПРЦ определяет наличие всего 10–100 клеток в пробе, тогда как иммунологическими и микроскопическими тестами можно определить наличие инфекции при количестве клеток не менее 103–105.
  • Универсальность . Сходство состава всех ДНК или РНК дает возможность применять универсальные методы лабораторных исследований, диагностируя сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы.
  • Скорость получения результатов . Поскольку для проведения ПЦР-диагностики не нужен посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени на нее не требуется. Весь цикл — от забора биоматериала до получения результатов — занимает 4–5 часов.
  • Диагностика латентных инфекций . ПЦР-методом диагностируются трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, встречающиеся в тех случаях, когда заболевание протекает в скрытой форме.

Методом ПЦР можно выявлять возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания.

Ограничения метода

Тем не менее не стоит думать, что ПЦР-диагностика не имеет недостатков. У нее есть свои ограничения, но их количество настолько незначительно, что не может отрицательно повлиять на популярность и эффективность метода:

  • Вероятность амплификации ДНК не только живого, но и погибшего микроорганизма . При проведении ПЦР-диагностики для контроля эффективности лечения необходимо соблюдать определенные требования. В частности, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1–2 месяца), за который происходит полное исчезновение возбудителя инфекции в организме.
  • Возможность возникновения перекрестной реакции . Подбор фрагментов ДНК (праймеров) осуществляется на основе знаний о генетическом строении конкретного микроорганизма. Но теоретически такой же фрагмент может присутствовать и у других микроорганизмов, геном которых на сегодняшний день еще не расшифрован. Их присутствие в пробе может привести к ложноположительному результату анализа.
  • Изменчивость микроорганизмов . Эта способность возбудителей к мутации иногда приводит к тому, что некоторые их штаммы становятся неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Чтобы уменьшить риски, разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Этапы исследования методом ПЦР

ПЦР-диагностика проводится в специальной лаборатории в несколько этапов.

  1. Забор биоматериала . Процедура, предшествующая непосредственному анализу, которая осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Забор делается с помощью стерильного оборудования только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть:
    • Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек: из уретры, из цервикального канала, со слизистой дыхательных путей и зева, из конъюнктивы. Забор проводится с помощью специального ершика, при этом недопустимо попадание в материал следов крови.
    • Моча . Собираются первые 50 г утренней мочи в стерильную емкость. Материал используется для диагностики мочеполовых инфекций.
    • Мокрота . Используется для ПЦР-диагностики туберкулеза и респираторных форм микоплазмоза и хламидиоза. Мокроту собирают в стерильный флакон в количестве 15–20 мг.
    • Кровь, сыворотка, плазма . С их помощью диагностируются гепатиты, герпес, ВИЧ-инфекция. Для анализа используется венозная кровь (1–1,5 мл), собранная у пациента натощак в стерильную пробирку. Хранить биоматериал можно не более суток при температуре 4°С. Замораживать кровь категорически запрещается.
    • Биологические жидкости . К ним относятся слюна, сок простаты, околоплодная, плевральная, спинномозговая, суставная жидкости. Собираются при помощи пункции с использованием стерильного инструментария в количестве 0,1–1,5 мл в стерильные пробирки.
    • Биоптаты , т.е. материалы, полученные путем биопсии. Обычно на анализ отправляют биоптаты двенадцатиперстной кишки или желудка, чтобы выявить хеликобактерную инфекцию. Объем материала 2–3 мм 3 .
  2. Хранение и транспортировка биоматериала . Хранить образцы можно при комнатной температуре не более 2 часов. Если необходимо длительное хранение, то пробы помещают в холодильник с температурой 2–8°С на срок не более одних суток. Допустимо хранение некоторых биоматериалов в течение двух недель в замороженном виде при температуре -20°С. Оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если она необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах с соблюдением всех правил хранения и перевозки биоматериалов.
  3. Выделение ДНК из образца . Способ выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца. Если, например, анализируется соскоб эпителиальных клеток, используется так называемый метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении в образец специального вещества, концентрации ДНК на сорбенте и его многократной отмывке буферным раствором.
  4. Проведение ПЦР . Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку. Туда же добавляется амплификационная смесь, имеющая сложный состав, в объеме 25 мл. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическом режиме проводится амплификация. Время ее проведения зависит от заданной программы и составляет 2–3 часа. Одновременно с опытными пробами проводятся контрольные — положительные , включающие в себя контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя, и отрицательные , не содержащие исследуемую ДНК. Количество циклов амплификации варьирует от 30 до 40, более 40 циклов проводить не рекомендуется, так как это способствует увеличению количества неспецифических продуктов в пробе.
  5. Регистрация результатов . Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества — бромистого этидия. Его соединение с фрагментами ДНК дает светящиеся полосы при облучении ультрафиолетовым излучением. Образец помещают в камеру для электрофореза и в течение 35–40 минут проводят разделение продуктов амплификации. После этого образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие оранжевой светящейся полосы свидетельствует о положительном результате.
  6. Интерпретация результатов исследования . Результат ПЦР-диагностики может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции, причем именно в данный момент времени. Количественный результат ПЦР-анализа оценить может только врач, они индивидуальны для разных типов инфекций. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

Цены на ПЦР-диагностику

Цена ПЦР-диагностики зависит от того, на какую конкретно инфекцию пациент планирует проверяться, от вида анализируемого материала, методики тестирования — качественной или количественной. Цена за определение одной инфекции составляет от 200 до 800 рублей в разных клиниках. Кроме того, к стоимости анализа добавится и плата за забор биоматериала — около 400 рублей. Средняя стоимость ПЦР-диагностики разных видов приведена в таблице 1.

Таблица 1 . Примерные цены на анализы ПЦР в Москве

Название анализа Цена, руб.
Определение ДНК хламидия 750
Определение ДНК микоплазмы хоминис 540
Определение микоплазмы гениталиум 350
Определение ДНК уреаплазмы 350
Гонококк, определение ДНК 350
Определение ДНК герпеса (разные типы) 350–600
Определение ДНК кандиды 570
Вирус краснухи, определение РНК 800
Дифференцированное определение ДНК ВПЧ (разные типы) 350–1900

Итак, многие медицинские центры предлагают провести ПЦР-исследование комплексно. В пакет услуги диагностики включается сразу несколько анализов, например, «ПЦР-8» (8 бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций) — 1400 рублей или «ПЦР-12» (12 половых инфекций) — 3500 рублей. Такая услуга позволяет существенно сэкономить деньги, поскольку при отдельном прохождении ПЦР-диагностики по каждой инфекции затраты будут намного больше.

Области применения метода полимеразной цепной реакции в настоящее время

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реферат

На тему: «Области применения метода полимеразной цепной реакции в настоящее время»

Введение

1. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) для разных видов научно-исследовательской работы

2. Применение ПЦР в микробиологии, медицине, диагностике инфекционных заболеваний

3. Применение ПЦР в урогинекологической практике

3. Применение ПЦР в ветеринарии

4. Применение ПЦР в пивоварении

5. Применение ПЦР в криминалистике

Заключение

Список использованной литературы

Введение

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе).

Разработка метода ПЦР во многом расширила методические возможности молекулярной генетики, и, в частности, генной инженерии, причем настолько, что это кардинально изменило и усилило научный потенциал многих ее направлений.

ПЦР не является панацеей в медицине или других областях науки, где метод также используется. Но сложно спорить с тем, что данная разработка Кэри Мюллиса открыла новые возможности в молекулярной биологии, судебной медицине, археологии, генетике и определении инфекционных заболеваний.

Актуальность рассмотрения применения ПЦР в различных областях состоит в том, что новейшие разработки, модификации данного метода имеют большое значение не только для научно-исследовательской деятельности, но и предполагает их переход в самые различные области медицины, сельского хозяйства и другие биотехнологические отрасли.

Целью написания реферата является описание областей применения метода ПЦР в настоящее время.

1. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) для разных видов научно-исследовательской работы

Метод ПЦР имеет большое значение в молекулярно-генетических исследованиях. Молекулярно-генетические методы — большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций (повреждений) в структуре участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. Так, основым этапом в молекулярно-генетических исследованиях является амплификация — накопление (умножение, клонирование) одинаковых фрагментов ДНК. При этом используется ПЦР, которая позволяет добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

ПЦР использовалась также и в проекте «Геном человека». Идея Проекта «Геном человека» была выдвинута в США. Картирование генов человека и выяснение нуклеотидной последовательности человеческого генома составляют основные, взаимосвязанные задачи Международной программы «Геном человека». Использование метода ПЦР в этом проекте способствовало ее большему распространению.

Еще одним примером использования метода ПЦР в научно-исследовательских целях является ее применения для анализа мутаций, вызванных действием различных систем редактирования генома (CRISPR/Cas или TALENs). Здесь проведение ПЦР является обязательным необходимым этапом в ходе анализа мутаций. Из клеток эукариот, обработанных искусственными нуклеазами, выделяют геномную ДНК, и методом ПЦР амплифицируют участок ДНК, содержащий сайт узнавания нуклеазы. Продукты ПЦР клонируют в плазмидном векторе с последующим секвенированием клонов.

Также методы ПЦР активно используют генетической инженерии. Так, для идентификации трансгенных животных вьщепляют ДНК из маленького кусочка хвоста и тестируют ее на наличие трансгена с помощью блот-гибридизации по Саузерну методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Чтобы определить, находится ли трансген в клетках зародышевой линии животного, трансгенную мышь скрещивают с другой мышью. Далее можно проводить скрещивание потомков для получения чистых (гомозиготных) трансгенных линий. Кроме того, используются методы введения мутаций с помощью праймеров с применением ПЦР. Так, был эффективно осуществлен сдвиг рамки считывания на один нуклеотид в сегменте гена lacZ плазмиды pBluescript II SK+ . Мутация была зашифрована в праймере 2. После первого раунда репликации образуется линейный гетеродуплекс, а при последующих раундах, накапливается мутантная плазмида из-за большого сродства прймера к измененной нити. Лигирование восстанавливает целостность кольцевой молекулы в месте стыка в 80% случаев.

Получение гибридных (слитых) белков — стандартная задача генетической инженерии, ставящая целью экспрессию, секрецию, детекцию или очистку целевого белка. В контексте белковой инженерии речь идет о создании белков, которые состоят из разных доменов, взятых у родственных или различных белков, и обладают полезными свойствами. Обмен доменами удобно проводить с помощью метода ПЦР. Для этого синтезируют праймеры, комплементарные к границам переносимого домен-кодирующего участка гена А, причем на их 5`-концах предусматривают последовательности, комплементарные к концам замещаемого домен-колируемого участка гена В (рис.1.) Эти последовательности сохраняются в получающемся дуплексе. Ген В клонируют в однонитевом векторе, что позволяет одной из нитей дуплекса связаться с ним и образовать своеобразный шунт замещаемому домен-кодирующему участку. Нить дуплекса служит праймером для копирования основной части вектора, которая содержит ген В с замещенным домен-кодирующим участком.

Рис.1. Последовательные этапы замены домен-кодирующего участка гена В на участок гена А с помощью метода ПЦР. Волнистые линии в праймерах — последовательности, комплементарные к концам замещаемого домена в гене В; ген В, клонированный в однонитевом векторе, выделен жирной линией.

2. Применение ПЦР в микробиологии, медицине, диагностике инфекционных заболеваний

Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний. Однако следует отметить, что метод ПЦР лишь дополняет спектр традиционных методов, используемых в микробиологической диагностике. Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно персистировать в организме хозяина.

ПЦР входит в число молекулярно-биологических методов, которые используются в микробиологической диагностике. Они позволяют обнаружить в образцах, взятых от больного, при вскрытии или из окружающей среды молекулы НК возбудителя. Их специфичность обусловлена индивидуальностью геномов. Высокую чувствительность молекулярно-биологические методы получили с применением ПЦР.

Применение ПЦР в урогинекологической практике. Среди инфекционных агентов, поражающих урогенитальный тракт большое внимание уделяется возбудителям латентных и хронических инфекций — хламидиям, микоплазмам. Для заболеваний, вызываемых этими возбудителями, характерна стертость клинической симптоматики, хроническое течение, часто приводящее к поражению репродуктивных функций — невынашиванию беременности, бесплодию. Исследования по изучению применения метода ПЦР для выявления Сhlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealiticum, проведенные в крупных клиниках, показали высокую эффективность данного метода. Признано, что по показателям чувствительности и оперативности ПЦР превосходит культуральный метод, принятый в качестве «золотого стандарта». Для диагностики хламидийной инфекции в настоящее время выпускаются как видоспецифические ПЦР-наборы, предназначенные для выявления фрагмента ДНК Сhlamydia trachomatis, Сhlamydia pneumoniae, так и родоспецифические, в которых детектируется общий для всех видов хламидий фрагмент ДНК. Таким образом, можно проводить дифференциальную диагностику инфекций хламидийной природы, что особенно важно при респираторных хламидиозах.

Для диагностики микоплазмозов выпускаются тест-системы на Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealiticum, Mycoplasma pneumoniae, для определения чувствительности микоплазм к антибиотикам тетрациклинового ряда и макролидам, а также для генотипирования Ureaplasma urealiticum, биовары которых (Parvo и T960) отличаются вирулентностью и в лечении которых могут применяться различные подходы.

Кроме того, производятся ПЦР-наборы для выявления Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, которые могут использоваться в диагностике латентных и хронических инфекций.

Следует особо выделить группу вирусов, поражающих урогенитальный тракт. Это вирус герпеса (HSV) и вирусы папилломы человека (HPV). Как известно, инфицирование HSV 2 типа, HPV 16, 18, 31, 33, 35, 45 типов несет риск злокачественных новообразований шейки матки у женщин. В настоящее время дифференциальная ПЦР-диагностика данных инфекций также возможна с помощью коммерческих наборов. Применение ПЦР в неонатологии. Целый ряд микроорганизмов способны поражать плод во время беременности. Это цитомегаловирус, токсоплазмы, вирус герпеса, вирус краснухи, микоплазмы, хламидии и др. Использование серологических тестов для определения этих инфекций у новорожденных неэффективно, поскольку формирование иммунной системы у ребенка происходит в течение нескольких месяцев, и наличие инфекционного агента может не сопровождаться выработкой специфических антител. С другой стороны, в крови новорожденного длительное время могут присутствовать материнские антитела класса IgG, способные проникать через плацентарный барьер. Таким образом, наличие специфических IgG у ребенка в первые месяцы жизни не свидетельствует о присутствии возбудителя.

Применение ПЦР-анализа значительно увеличивает возможности диагностики неонатальных инфекций, в том числе и на внутриутробном этапе. Материалом в этом случае может служить амниотическая жидкость или ворсинки хориона. Эффективным является ПЦР-анализ ЦМВ у новорожденных. Для анализа используется моча или слюна ребенка. При конъюнктивитах и пневмонии новорожденных исследование эпителиального соскоба с конъюнктивы или задней стенки глотки методом ПЦР позволяет выявлять этиологический фактор, которым часто являются хламидии, микоплазмы. полимеразный цепной инфекционный бактериальный

Применение ПЦР в пульмонологии и фтизиатрии. Частой причиной атипичных пневмоний, рецидивирующих хронических бронхитов являются микоплазмы и хламидии. Диагностика этих возбудителей традиционными методами микроскопии и бакпосева неэффективна. ПЦР позволяет не только диагностировать хламидиозы и микоплазмозы, но и проводить видовую идентификацию возбудителя (С. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. pneumoniae).

Использование метода ПЦР позволяет значительно улучшить раннюю диагностику туберкулеза. Метод ПЦР сочетает в себе высокую чувствительность, которая не уступает культуральному методу и равна 10?50 копий генома, и высокую оперативность (время проведения анализа — 6?8 часов). Материалом для анализа может служить мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, спинномозговая жидкость, экссудаты, моча, что позволяет эффективно выявлять как легочные, так и внелегочные формы инфекции. В настоящее время разработаны и появились на рынке ПЦР-наборы для определения устойчивости микобактерий к антибиотикам.

Применение ПЦР в клинике инфекционных заболеваний. Сегодня наиболее всесторонние преимущества ПЦР при диагностике вирусных заболеваний можно продемонстрировать, рассматривая инфекционный процесс, обусловленный вирусом гепатита С (ВГС).

Особую диагностическую ценность ПЦР для обнаружения этого вируса представляет по следующим причинам:

1) отсутствие способа культивирования ВГС;

2) наборы для антигенной диагностики не существуют;

3) реакция образования антител к ВГС настолько замедлена, что диагноз во время острой фазы инфекции, как правило, поставить невозможно.

Поэтому в настоящее время становится общепризнанным использование технологии ПЦР для диагностики, контроля качества лечения и эпидемиологического анализа заболеваемости, обусловленной ВГС. При этом только технология ПЦР позволяет решать следующие задачи: 1) проводить диагностику острой инфекции при позднем выявлении антител к ВГС; 2) осуществлять этиологическую диагностику хронического гепатита С у иммуносупрессированных пациентов; 3) оценивать эффективность противовирусной терапии; 4) выявлять виремию у доноров крови с нормальным уровнем аминотрансфераз; 5) определять возможную контаминацию препаратов крови; 6) оценивать широту распространения гепатита С.

Кроме диагностики вирусных гепатитов ПЦР нашла применение в диагностике таких заболеваний, как СПИД, сальмонеллез, дифтерия, бруцеллез, холера, токсоплазмоз, туляремия и др.; в гастроэнтерологии— для выявления геликобактериоза.

3. Применение ПЦР в ветеринарии

Инфекционная патология в ветеринарии охватывает широкий круг болезней, различных как по характеру течения (острые, хронические, латентные), степени распространения (от спорадических случаев до эпизоотии), так и по сложности их диагностики. Важное, а при некоторых болезнях решающее значение имеют серологические исследования, направленные на выявление антител, вырабатываемых организмом животного в ответ на внедрение инфекционного агента или вакцины. Несмотря на ряд достоинств, методы, основанные на этом принципе, обладают недостаточной чувствительностью и специфичностью. Существенный прорыв был сделан в последние годы, когда для диагностических целей привлекли методы генной инженерии и биотехнологии. Для диагностики инфекционных заболеваний наибольшее применение нашёл способ амплификации (умножения) нуклеиновых кислот: полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция, NASBA-метод и др.

ПЦР в лабораторной диагностике инфекций характеризуется быстротой, непревзойдённой чувствительностью и высокой специфичностью, что позволяет обнаруживать микроорганизмы, присутствующие в очень низких концентрациях (1-10 возбудителей в пробе). При этом ДНК инфекционных агентов может быть достаточно эффективно экстрагирована из любой биологической жидкости или ткани, а также из проб объектов окружающей среды (почвы, воды и т.д.) и продуктов питания. Полимеразная цепная реакция эффективна при обнаружении бактериальных, грибковых, паразитарных и вирусных патогенов.

К настоящему времени ветеринарными специалистами уже разработаны тест-системы для диагностики методом ПЦР таких заболеваний, как туберкулёз, сибирская язва, лейкоз, чума крупного рогатого скота, бешенство, ящур, бруцеллез, кампилобактериоз, листериоз, хламидиоз животных, классическая чума свиней, респираторно-репродуктивный синдром свиней, парвовирусная инфекция свиней, энцефаломиокардит свиней, сальмонеллёз, стафилококкоз, микоплазмоз, болезнь Марека, реовирусная инфекция, болезнь Гамборо, инфекционный бронхит птиц, ньюкаслская болезнь; чума плотоядных, вирусный энтерит норок, вирусный гепатит утят и др.

Среди методов лабораторной диагностики гриппа птиц наиболее эффективным считается метод полимеразной цепной реакции. Используя праймеры к НА, NA и М-генам различных субтипов вируса гриппа, Zhang W. и Evans D.N. (1991 г.) впервые продемонстрировали возможность детекции вирусов. Однако исследования были выполнены на музейных штаммах.

Главными преимуществами ПЦР в сравнении с методами культурального подхода являются его более высокая чувствительность, быстрота и безопасность для персонала. При сравнении с серологическими методами ПЦР существенно выигрывает, поскольку позволяет выявлять вирусы гриппа на самых ранних стадиях, задолго до появления антител.

Кроме явных диагностических преимуществ, его дополняют методом секвенирования ДНК, и тогда он является универсальным молекулярно-генетическим подходом к определению большинства биологических свойств вирусов гриппа птиц, позволяющим выявлять родство циркулирующих штаммов, предсказывать его опасность для человека и эффективность противовирусной терапии.

Хламидиозная инфекция широко распространена практически среди всех видов млекопитающих и наносит существенный экономический ущерб различным отраслям животноводства, вызывая гибель животных, патологию их воспроизводительных органов, аборты, рождение мёртвого или нежизнеспособного приплода.

Одним из самых распространенных хронических инфекционных заболеваний с/х животных, наносящих значительный экономический ущерб животноводству, является лейкоз крупного рогатого скота (ЛКРС). Возбудитель болезни — РНК-содержащий лимфотропный вирус семейства Retroviridae (род дельтаретровирус), вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), обладающий интеграционным механизмом взаимодействия с геномом клетки-хозяина. Н.А. Мальцева и др. при исследовании лейкоза крупного рогатого скота использовали 2 метода диагностики — РИД (реакции иммунодиффузии) и ПЦР. Разработанный, испытанный и представленный ими метод диагностики при использовании ПЦР показал более высокий уровень чувствительности и специфичности относительно применяемого в практике ветеринарии метода серологического анализа РИД. А именно, из 860 исследованных образцов крови крупного рогатого скота на наличие ВЛКРС-инфекции в РИД выявлено 211 (24,5%) проб сывороток крови, имеющих антитела к вирусу, тогда как с помощью ПЦР обнаружено 366 животных-вирусоносителей, что составляет 42,5% от числа исследованных. Таким образом, можно сделать вывод, что метод ПЦР-диагностики ВЛКРС-инфекции является более чувствительным, чем применяемый РИД, и позволяет выявлять инфицированных животных на самых ранних стадиях инфекционного процесса.

4. Применение ПЦР в пивоварении

ПЦР представляет собой одну из наиболее многообещающих технологий, позволяющих быстро обнаруживать присутствие микробиологических контаминантов в пивоварении, но до сих пор она еще недостаточно широко применяется в рутинных анализах.

Специфичность ПЦР такова, что по одному сценарию можно различать грамположительные и грамотрицательные бактерии, по другому — выявлять такие виды, как Pediococcus damnosus и Obesumbacterium proteus, причем и то и другое в ходе одного анализа. Использование такой высокоспецифичной методики идентификации оправдано применительно к засевным дрожжам, где контаминация может присутствовать на уровне единичных клеток, или применительно к любому объекту, для которого контаминация микроорганизмами недопустима в принципе.

Первоначально для идентификации контаминантов пивоваренного производства (как в засевных дрожжах, так и в готовом продукте) было разработано большое число ПЦР-тестов, однако ни один из них не достиг уровня надежности подсчета на чашках, что не компенсируется даже преимуществом выигрыша во времени (часы вместо дней). Главными проблемами остаются большая чувствительность метода, что увеличивает число «ложноположительных» показаний, его высокая стоимость, а также относительная трудность выполнения анализов. Кроме того, по сравнению с подсчетом на чашках достоверность выделения незначительных количеств микроорганизмов в готовых непастеризованных продуктах уменьшается (особенно относительно загрязняющих бактерий). К имеющимся сейчас в употреблении тестам относятся тесты по идентификации различных пивоваренных контаминантов (в том числе молочнокислых бактерий) и специфические тесты на такие контаминанты, как Obesumbacterium, Pediococcus и Lactobacillus, позволяющие даже различать молочнокислые бактерии по их устойчивости к хмелю.

Дальнейшее совершенствование ПЦР-методов было направлено на тестирование ингредиентов сырья относительно наличия генетически модифицированных продуктов, особенно кукурузы, и хотя такое применение ПЦР-технологии прямо не связано с микробиологической контаминацией, оно предствляет определенную ценность для пивоварения. В новых более автоматизированных технологиях (например, как Light Сус1егш фирмы Roche) достоверность и надежность ПЦР-методов была увеличена, и дальнейшее развитие в этой области несомненно будет способствовать более широкому их применению в пивоваренной промышленности.

Специфические ПЦР-праймеры, которые тщательно конструируются для амплификации последовательности-мишени, обычно имеют размер от 15 до 25 нуклеотидов, и для этого необходимо предварительное знание интересующей исследователя последовательности ДНК. Альтернативой является использование меньших неспецифических или имеющих случайный состав праймеров с размерами от 9 до 12 нуклеотидов. Благодаря своим меньшим размерам эти «случайные» праймеры связываются с несколькими различными сайтами ДНК на последовательности ДНК любого микроорганизма. Использование таких меньших по размеру случайно составленных или неспецифичных праймеров для ПЦР-диагностики назвали методом ПЦР полиморфной ДНК, амплифицированной случайным образом (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA). В ходе RAPD-PCR из-за связывания со значительно большим числом участков в геноме обычно образуется несколько ПЦР-продуктов, которые затем разделяют электрофорезом в агарозном геле и получают «отпечатки пальцев» ДНК или профили, специфические для рода или даже вида микроорганизма. RAPD- отпечатки зависят от составляющих праймеры последовательностей, условий реакции в каждом цикле амплификации (которые, как правило, менее строгие, чем при специфическом ПЦР-тесте, для максимального увеличения числа сайтов связывания) и источника ДНК.

Эту технологию использовали для описания свойств и дифференцирования пивоваренной микрофлоры, включая виды Pediococcus, Lactobacillus и Obesumbacterium, а также штаммов дрожжей для эля и лагерного пива. Вместо смеси олигонуклеотидов для выполнения RAPD-PCR можно использовать многократно повторяющиеся специфические последовательности (полиGT-олигонуклеотиды). В дрожжевом геноме полиGT-последовательности локализованы на концах хромосом и рассматриваются как «горячие точки» генетической рекомбинации. Эта методика крайне полезна для идентификации отдельных видов и разновидностей штаммов и для ускоренной идентификации штаммов ее можно включить в состав баз данных. С практической точки зрения такая методика требует наличия колоний чистых культур. Если культура смешана с одним или несколькими штаммами бактерий или дрожжей, получаются аномальные образцы, которые невозможно сопоставить с имеющимися штаммами. В частности, эта методика не подходит для выявления бактериальной контаминации дрожжей.

5. Применение ПЦР в криминалистике

ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью электрофореза ДНК. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (англ. genetic fingerprint).

Метод ПЦР был легко адаптирован для анализа локусов тандемного повтора. В США ФБР стандартизировало набор из 13 тандемных повторов для ДНК-профилирования, а также организовало объединённую базу данных ДНК «Combined DNA Index System (CODIS)» для судебно-медицинской идентификации в уголовных делах. Подобные анализы и базы данных были созданы и в других странах. Кроме того, разработаны комплекты инструментальных средств, которые позволяют анализировать одиночный нуклеотидный полиморфизм (ОНП). .

В ходе получения профиля ДНК идет поиск сегментов, получивших название «коротких тандемных повторов» — повторяющихся фрагментов, содержащих по 2-6 нуклеотидов, встречающихся во всем генетическом коде. Число повторов каждого STR индивидуально для каждого человека, благодаря чему измерение длины и количеств различных STR позволяет точно соотнести ДНК с человеком.

Основные этапы технологии генетического анализа STR-маркеров для установления личности:

1. Выделение исследуемого образца

2. Количественное определение ДНК

3. Амплификация ДНК (ПЦР)

4. Генетический анализ коротких повторяющихся повторов (STR)

5. Интерпретация полученных результатов генетического анализа

Для проведения генетического анализа ДНК человека в судебно-медицинских образцах крайне важно проведение ее количественного определения, особенно для целей генетического анализа по установлению личности. В ряде случаев, исходя из поставленных судебно-медицинским экспертом вопросов, стоят задачи по точному определению количества ДНК человека и/или мужской ДНК в образцах, содержание которых может варьировать в широком диапазоне в зависимости от источника ДНК и его качества. Для такого генетического анализа удобно использовать автоматизированные системы ПЦР в режиме реального времени.

Несомненно, методы на основе ПЦР имеют ряд преимуществ. Во-первых, они позволяют проводить непосредственное измерение длины каждого гипервариабельного STR-локуса. Во-вторых, получить результаты ПЦР-анализа удается обычно в течение 24 часов, что значительно сокращает время исследования. И наконец, ПЦР очень удобна в тех случаях, когда имеется ничтожно малое количество образца. Чувствительность ПЦР — это также и слабая ее сторона. В случае образца, загрязненного посторонней ДНК, может быть произведено множество ее копий: процесс амплификации настолько эффективен, что даже нескольких случайных молекул ДНК, попавших в образец, бывает достаточно для того, чтобы прийти к ложным выводам. Артефакты возможны также как результат неправильного подбора условий ПЦР, при амплификации неспецифических (неаллельных) фрагментов и в некоторых других случаях. Еще одним недостатком определения STR-фрагментов является то, что распределение частот аллелей в популяции не такое равномерное. Вследствие этого лаборатория, использующая STR анализ, вынуждена исследовать больше локусов для получения того же количества информации относительно подобия генетического профиля двух людей.

Заключение

Таким образом, открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень.

Область применения ПЦР велика и постоянно расширяется: диагностика генетических заболеваний, обнаружение генетического материала патогенных микроорганизмов в клинических образцах, синтез гибридизационных зондов, создание библиотек кДНК из малых количеств мРНК, мультипликация ДНК для целей секвенирования, направленный мутагенез. Кроме применения метода ПЦР в медицине и научных исследованиях, ее также активно используют в самых различных отраслях, такие как пивоварение, ветеринария, криминалистика.

Список использованной литературы

2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ.-М.: Мир, 2002. 589 с.

5. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Т1: Генная и белковая инженерия. М.: Наука, — 526 с.

6. Прист Ф. Дж., Й. Кэмпбелл. Микробиология пива / (ред.); пер. с англ. Под общ. ред. Т. В. Мелединой и Тыну Сойдла. — СПб: Профессия, 2005. — 368 с.

7. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. 2-е изд, перераб. и доп.:Учебник для вузов. СПб.: Изд-во СПбГТУ, 2002. 522 с.

8. https://ru.wikipedia.org/wiki/Полимеразная_цепная_реакция

9. https://ru.wikipedia.org/ /wiki/Генетическая_дактилоскопия

Этапы полимеразной цепной реакции (ПЦР). Проведение ПЦР в лаборатории

Проведение ПЦР-анализа (PCR diagnostics) начинается с забора материала для исследования врачом-гинекологом, урологом или дерматовенерологом. Качество, достоверность полученных впоследствии результатов обеспечивается высочайшей квалификацией и огромным опытом работы врачей медицинского центра «Евромедпрестиж» , соблюдающих все необходимые правила проведения ПЦР-анализа: полная стерильность, использование исключительно одноразовых материалов.

Забранный материал со щеточки помещают в контейнер с физраствором. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР — лабораторию.

Проведение в лаборатории ПЦР-анализа происходит в три этапа:

  1. Выделение ДНК
  2. Амплификация ДНК-фрагментов
  3. Детекция ДНК-продуктов амплификации

Выделение ДНК — это первоначальный этап проведения ПЦР-диагностики, суть которого заключается в следующем: врач забирает у пациента материал для исследования и подвергает его специальной обработке. В процессе обработки происходит расщепление двойной спирали ДНК на отдельные нити. В материал пациента добавляется специальная жидкость, растворяющая органические вещества, мешающие «чистоте» проведения реакции. Таким образом удаляются липиды, аминокислоты, пептиды, углеводы, белки и полисахариды. В результате образуется ДНК или РНК.

Принцип метода ПЦР заключается в «строительстве» новых ДНК или РНК инфекций. Без удаления клеточного материала осуществить это невозможно.

Количество времени, затраченного на выделение ДНК, зависит от возбудителя инфекции и от вида используемого для исследования методом ПЦР материала. Например, для подготовки крови к следующему этапу требуется 1,5–2 часа.

Наименование услуги Стоимость
Жидкостная цитология 2 200 руб.
Соскоб на грибы (демодекс) 650 руб.
Анализ мочи общий 350 руб.
Анализ мочи (2-х стаканная проба) 630 руб.
Анализ кала общий (копрограмма) 430 руб.
Смотреть весь прайс-лист

Амплификация ДНК

Для осуществления следующего этапа ДНК-диагностики — амплификации ДНК — врачи используют так называемые ДНК-матрицы — молекулы ДНК инфекций, на которые впоследствии будет происходить «клонирование» ДНК. Уже упоминалось, что наличие полной ДНК инфекции необязательно, для проведения этого этапа достаточно небольшого кусочка молекулы ДНК, который присущ только данному микробу (инфекции).

В основе амплификации ДНК и соответственно в основе всего принципа ПЦР-реакции лежит естественный для всего живого процесс достраивания ДНК — репликации ДНК, который осуществляется путем удвоения единичной цепочки ДНК.

Начав с одного-единственного фрагмента ДНК, врач-лаборант копирует его и увеличивает количество копий в режиме цепной реакции: после первого цикла у вас уже есть 2 фрагмента, после второго цикла — 4, после третьего — 8, после четвертого — 16, затем 32, 64, 128, 256… С каждым циклом происходит удвоение числа копий, и после двадцати циклов счет уже идет на миллионы, а после тридцати — на миллиарды. Цикл длится считанные минуты и сводится к определенному изменению температурного режима в очень небольшом химическом реакторе. Здесь в растворе в достаточном количестве находятся все нужные компоненты синтеза, прежде всего, нуклеотиды А, Г, Т и Ц, а также проведены тонкие подготовительные химические операции для того, чтобы с каждого готового отрезка ДНК тут же снималась точная копия, затем с этой копии — снова копия, в этом и состоит разветвленная цепная реакция.

Путем присоединения к цепи ДНК праймеров — искусственно синтезированных «кусочков» ДНК (нуклеотидных пар), аналогичных ДНК микробов (инфекции) — образуются две короткие, состоящие из двух цепей участков ДНК, спирали, необходимые для синтеза будущей ДНК.

Синтез новой цепи происходит путем достраивания каждой из двух нитей ДНК. Процесс амплификации происходит с помощью специфического участка — ДНК-полимеразы, давшему название лабораторному методу. Полимераза выступает в роли катализатора реакции и следит за последовательным прикреплением нуклеотидных оснований к растущей новой цепи ДНК.

Таким образом, амплификация ДНК представляет собой многократное увеличение числа копий ДНК, которые специфичны, т. е. присущи только определенному организму. Нет необходимости достраивать всю цепь ДНК, чтобы увидеть возбудителя инфекции. Нужен только тот участок, который характерен для данной бактерии как для индивидуальности.

Все многочисленно повторяющиеся этапы амплификации происходят при различных температурах. Для проведения ПЦР-анализа используется специально программируемое оборудование — ПЦР — термостат или амплификатор, которое автоматически осуществляет смену температур. Амплификация проводится по заданной программе, соответствующей виду определяемой инфекции. В зависимости от программы и вида определяемой инфекции процесс автоматизированной ПЦР занимает от 2 до 3 часов.

Важное значение в ПЦР-диагностике играет квалификация врача-лаборанта, проводящего анализ, от него зависит правильность настройки ПЦР-оборудования и интерпретация полученных результатов. Врачи медицинского центра «Евромедпрестиж» имеют большой опыт в проведении ДНК-диагностики, что обеспечивает достоверность полученных результатов исследования и гарантирует положительный успех в лечении инфекционных заболеваний. Чтобы сдать анализы методом ПЦР и провести полную диагностику и лечение инфекционных заболеваний в нашем медицинском центре «Евромедпрестиж».

В процессе детекции продуктов амплификации проходит разделение полученной смеси продуктов амплификации. К смеси добавляется специальные растворы, которые наделяют фрагменты ДНК способностью флуоресцировать — отражаться оранжево-красными светящимися полосами. Образующееся свечение выдает присутствие ДНК вирусов, микробов или бактерий в забранном у пациента на ПЦР-анализ материале.